[품질관리] LC(또는 HPLC) 란?(원리, 구성요소)

 
액체 크로마토그래피(LC, Liquid Chromatography)는 제약, 환경, 식품 및 화학 산업 전반에 걸쳐 사용되는 가장 강력하고 다재다능한 분석 기술 중 하나로, 복잡한 혼합물에서 성분을 분리, 식별 및 정량화할 수 있습니다. LC 분석기술은 초기 개발 이후 크게 발전했으며, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, High-Performance Liquid Chromatography)가 최근의 실험실에서 사용되는 표준 형식이 되었습니다.
 오늘 포스팅에서는 액체 크로마토그래피의 기본 원리, 분석 유형에 대해 다루어 봅니다.
 

LC의 기본 원리

 LC는 액체 이동상과 고체 고정상 사이의 화합물의 차별적 분배에 기초하여 성분을 분리합니다. 시료가 흐르는 이동상에 주입되면 그 성분들은 두 상과 다르게 상호작용하여 시스템을 통과할 때 분리됩니다. 즉, 고정상에 더 큰 친화력을 가진 화합물이 이동상에 더 큰 친화력을 가진 화합물에 비해 컬럼을 통해 더 느리게 이동하기 때문에 시료의 성분간 분리를 이끌어 낼 수 있습니다.
 

크로마토그램의 원리

 
 기본 메커니즘에는 시료 성분이 고정상과 이동상 사이에서 평형을 이루는 과정도 포함됩니다. 이 과정에서 이동상이 컬럼을 통해 계속 흐르면서 시료내 각 성분을 화학적, 물리적 특성에 따라 결정된 서로 다른 속도로 운반합니다. 시료 성분이 고정상과 강하게 상호작용할 때, 이 성분은 더 많은 시간 동안 이 상에 결합되어 있으므로 컬럼을 통과하는 속도가 더 느려집니다. 반대로, 고정상에 대한 친화력이 적은 성분은 이동상에 더 많은 시간을 보내므로 시스템을 통해 더 빠르게 이동합니다.
 액체 크로마토그래피 시스템에서 분리 효율은 고정상의 특성, 이동상 조성, 컬럼 치수, 유속, 온도 등 여러 요인에 영향을 받습니다. 이러한 매개변수를 조작함으로써 분석가는 특정 분석 과제에 맞게 분리를 최적화할 수 있습니다. 화합물이 컬럼에서 용출되는 데 걸리는 시간을 머무름 시간(retention time)이라고 하며, 이는 화합물 식별을 위한 정성적 매개변수 역할을 합니다.
 액체 크로마토그래피에서 분리는 시료 성분들이 고정상과 이동상 사이를 반복적으로 분배되는 과정에서 발생합니다. 각 성분은 고유한 물리화학적 특성에 따라 두 상 사이에서 서로 다른 평형 상수를 가집니다. 이러한 평형 상수의 차이가 서로 다른 이동 속도로 이어져 결국 혼합물의 각 성분이 서로 분리됩니다. 분석물질이 검출기를 통과할 때 생성되는 신호는 시간에 따른 그래프인 크로마토그램으로 기록됩니다.
 

 
HPLC 시스템 구성 요소
 HPLC는 고해상도 분리를 달성하기 위해 함께 작동하는 여러 필수 구성 요소로 이루어져 있으며, 각 요소들은 다음과 같습니다.
 

이동상(Mobile Phase)

• 일반적으로 물, 유기 용매, 또는 완충 용액으로 구성
• 저장소(일반적으로는 bottle)에 보관
• 높은 순도의 용매로 제조되어야 함
• 분석물질과 용매 사이의 의도하지 않은 상호작용을 방지하기 위해 잦고 수준높은 관리 필요
• 사용하기 전 분석을 방해할 수 있는 입자와 용해된 가스를 제거하기 위해 여과 및 탈기 과정을 거쳐야 함
• 대체로 두 개 이상의 용매를 특정비율로 혼합 (일반적으로 그래디언트 시스템 이용)

 

고압 펌프(High pressure pump)

• 정확한 유속으로 이동상을 공급하여 시스템 전체에 일정한 압력을 유지하기 위해 필요
• 재현 가능한 분리와 신뢰할 수 있는 검출을 보장하기 위해 흔들림 없는 흐름을 제공해야 함

 

시료 주입기(Sample Injector)

• 시스템 압력을 방해하지 않고 정확한 양의 시료를 흐르는 이동상에 주입
• 일반적으로 여러 시료를 자동으로 주입할 수 있는 자동시료주입장치 사용 (처리량 및 효율성 향상)
• 컬럼 과부하 방지를 위해 주입 부피도 고려되어야 함 (분리 성능이 저하방지)
• 고압 밸브, 샘플 루프로 구성(시료가 루프에 채워진 후, 밸브가 회전하여 시료를 이동상의 흐름 경로로 전환)
• 자동시료주입장치 : 온도 조절 기능, 시료 희석 기능, 전처리 기능 등 다양한 기능 보유

 

컬럼(Column)

• 컬럼은 모든 크로마토그래피 시스템의 핵심 (실질적인 분리가 일어나는 곳)
• HPLC 컬럼은 일반적으로 고정상 입자로 채워진 스테인리스 스틸 튜브로 구성
• 고정상 : 다공성 입자로 구성, 일반적으로는 실리카 기반이나 선택성 향상을 위해 다양한 고정상 선택하기도 함
• 컬럼의 입자 크기는 1.8μm에서 10μm까지 다양하며, (입자가 작을 수록 높은 분리 효율, 높은 압력)
• pH 영향을 받음 : 실리카 기반 고정상은 pH 에 크게 영향을 받음 (최근 하이브리드 실리카 및 폴리머 기반 고정상은 확장된 pH 범위에서 안정성을 제공)
• 그 외에 고려해야할 사항 : 컬럼 길이, 내경, 입자 크기, 고정상 물질

 

검출기(Detector)

• 컬럼에서 분리된 후, 용출된 화합물을 검출하는 장소
• 분석물질의 특성에 기반하여 다양한 검출 기술을 사용
• 종류 : UV-Vis detector, PDA(Photodiode array detector), FLD(fluorescence detector), RID(Refractive index detector), 질량 분석기(mass spectrometer)등
• 검출기는 각 화합물의 양에 비례하는 전기 신호를 생성하고, 이 신호는 크로마토그램으로 시각화
• PDA : 단일 파장에서의 흡광도뿐만 아니라 UV-Vis 스펙트럼의 전체 범위를 기록할 수 있음(미지시료 식별에 유리)
• 질량 분석기 : 복잡한 혼합물에서 특정 화합물을 식별하고 정량화에 유리

 

데이터 획득 및 처리

• 컴퓨터 소프트 웨어로 제어 : 방법 매개변수부터 데이터 수집 및 처리까지 분석의 모든 측면을 관리
• 소프트웨어 상에서 자동 작동, 분석법 개발, 정량적 계산 및 보고 등 데이터 분석 가능
• 일반적으로 크로마토그램 내의 피크 면적 또는 높이를 측정하여 각 화합물의 농도를 결정
• 최근에는 실험실 정보 관리 시스템(LIMS)과 통합되어 대량의 분석 데이터를 체계적으로 관리